sábado, 24 de agosto de 2013

Coloração de Esporos (Wirtz-Conklin)

Hoje trarei como tema a Coloração de Esporos, sugestão da leitora Micaela Paixão! Desde já obrigado pelo contato e pela sugestão! Mandem sempre sugestões e mensagens que assim que possível responderei todas! 


INTRODUÇÃO 

1. Endósporos bacterianos 

A esporulação é um fenômeno de grande importância ecológica para certas espécies de bactérias. A produção de endósporos é um mecanismo protetor que permite a sobrevivência das bactérias por longos períodos, sob condições extremas, como ausência de água e/ou nutrientes. São por isso, consideradas estruturas de resistência.


Figura 1
A descoberta dos endósporos bacterianos (Figura 1) data de 1838, tendo sido descritos por Ehrenberg como sendo corpos refractários à coloração, formados no interior de células bacterianas 
(Hornstra et al., 2006). Estudos, feitos de modo independente por Cohn e Koch em 1876, demonstraram a resistência destas estruturas a temperaturas elevadas (100ºC) e a sua germinação sob condições diferentes das que tinham permitido a sua formação. Koch, em 1888, descreveu os principais acontecimentos envolvidos na esporulação e germinação de Bacillus anthracis (Hornstra et al., 2006). As investigações com endósporos registaram um acentuado desenvolvimento a partir de 1950, com a contribuição de vários laboratórios (Gould, 2006). 

Figura 2
Os endósporos bacterianos têm uma estrutura complexa constituída por várias camadas protectoras altamente resistentes (Figura 2). O exospório constitui a camada mais externa do endósporo, embora não esteja presente em 
todas as espécies. É constituído essencialmente por proteínas, água e hidratos de carbono. Quando presente, constitui a camada mais espessa do endósporo. 

Apresenta-se fracamente ligado à camada seguinte e com a configuração de um sáculo ou balão (Figura 3) (Ohye et al., 1973). Possui uma camada basal paracristalina com proteínas (53%) e uma outra mais externa com prolongamentos ou filamentos de natureza glicoproteíca (20%), lípidos (18%) e resíduo seco (4%) (Gerhardt e Ribi, 1964). 



Figura 3
O exospório corresponde a cerca de 2% do peso seco do endósporo. A sua função é pouco conhecida, mas uma vez que ocorre nas espécies patogénicas e apresenta uma natureza hidrofóbica, poderá estar relacionado com a interacção com os organismos hospedeiros (Hornstra et al., 2006). A sua relação com a elevada resistência dos endósporos não está, no entanto, documentada (Dricks, 2003). 

A capa é composta essencialmente por camadas de queratina e proteínas específicas intercruzadas que conferem proteção contra enzimas hidrolíticas, como a lisozima, e também contra espécies reativas de oxigénio, oxidantes químicos e solventes orgânicos (Dricks, 1999; Nicholson et al., 2000; Setlow et al., 2000). Admite-se também que seja importante na proteção e resistência durante a germinação, preservando a integridade contra agressões mecânicas e excluindo moléculas tóxicas de grandes dimensões. Ao mesmo tempo, permite que as pequenas moléculas penetrem e interatuem com receptores de germinação localizados no interior dos endósporos (Young e Setlow, 2004; Hornstra et al., 2006).

Para além do seu papel durante a germinação, a capa está envolvida em interações ecológicas permitindo as alterações de volume (hipertrofia e hipotrofia), que acompanham as mudanças estruturais do endósporo durante a sua formação e a sua germinação (Dricks, 1999; Setlow et al., 2003). A espessura e o número de camadas de polipéptidos que a capa pode apresentar, é variável entre espécies (Dricks, 1999). 

A função da membrana externa, entre o córtex e a capa não é ainda completamente conhecida, mas parece ser importante no processo de esporulação (Setlow et al., 2000). Esta membrana foi inicialmente considerada permeável. Contudo, resultados posteriores mostraram o contrário. Atualmente, admite-se que não deve funcionar como barreira já que foi experimentalmente demonstrado que a remoção desta membrana e da capa, não afetava a resistência dos endósporos ao calor, a radiações e a agentes químicos (Nicholson et al., 2000; Setlow et al., 2000). 

O córtex é composto por uma espessa camada de resíduos de ácido murâmico δ-lactâmico, um peptidoglicano característico dos endósporos (Warth e Strominger, 1972). O grau de ligação cruzada das cadeias de peptidoglicano ao longo do córtex é variável entre as espécies e pode permitir uma maior expansão e contracção do endósporo em resposta a alterações iónicas do meio (Dricks, 2003). A formação do córtex durante o processo de esporulação, parece ser determinante na dormência do endósporo, bem como na sua resistência à destruição pelo calor (Atrih e Foster, 2001). Esta estrutura parece ainda ter um importante papel durante a germinação, uma vez que ao ser degradado permite a expansão do núcleo do endósporo (Nicholson et al., 2000). A constituição do córtex é muito estável de espécie para espécie (Atrih e Foster, 2001).  

A separar o córtex da parte mais interna do endósporo, o núcleo, existe uma membrana interna que funciona como barreira selectiva e que aparenta ter um importante papel na primeira fase da germinação (Vepachedu e Setlow, 2007). A membrana interna apresenta poros ou canais que permitem, de um modo regulado, a libertação de cálcio e ácido dipicolínico (DPA), compostos envolvidos na activação das enzimas hidrolíticas que degradam o córtex durante o processo de germinação (Vepachedu e Setlow, 2007). 

O núcleo do endósporo contém as estruturas que permitirão a formação da nova célula vegetativa: a parede celular (com peptidoglicano), a membrana citoplasmática, o nucleóide (material genético), enzimas e pequenas moléculas. O DPA é um composto característico dos endósporos e encontra-se no núcleo, sendo responsável pela diminuição da quantidade de água e o consequente aumento da resistência ao calor (Paidhungat et al., 2001). Este composto é produzido na célula vegetativa durante a esporulação e forma um complexo com catiões divalentes de cálcio, que constituem 5 a 15% do peso seco do endósporo (Hornstra et al., 2006). O mecanismo que torna o núcleo desidratado na fase final da esporulação não é ainda bem conhecido (Melly et al., 2002). O conteúdo de água do núcleo é cerca de 35 a 45% em comparação com o valor de 80% característico das células vegetativas, o que poderá explicar a elevada estabilidade das biomoléculas aí existentes e contribuir para a resistência dos endósporos (Setlow, 1994; Setlow et al., 2000). O pH do núcleo do endósporo é cerca 
de 6.3 a 6.5, o que é inferior ao pH do citoplasma das células vegetativas (Setlow e Setlow, 1980). As proteínas SASP (Small Acid Soluble Proteins) correspondem a cerca de 3 a 6 % do total de proteínas do endósporo. Esta classe de proteínas é expressa no final da esporulação e protege o DNA durante a dormência do endósporo, tornando a sua estrutura mais estável e compacta (Setlow, 1995).


2. Endósporos em espécies do género Bacillus 

Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Thermoactinomyces e Sporosarcina são alguns dos géneros bacterianos em que ocorrem genes de esporulação que levam ao desenvolvimento de alterações morfológicas das células vegetativas originando endósporos. Estes últimos podem ser classificados quanto à sua localização como centrais, terminais e subterminais (Figura 4)


Figura 4 - Endósporos centrais (A), terminais (B) e subterminais (C) ( Madigan e Martinko, 2006). 

O gênero Bacillus, utilizado neste trabalho como modelo biológico, agrupa bactérias Gram positivas, aeróbicas e anaeróbias facultativas está bem representado no solo. A maioria das espécies é móvel e durante a esporulação produzem catalase, em condições aeróbias. Sobrevivem em diferentes ambientes a temperaturas que variam dos 3ºC aos 75ºC, com uma gama de tolerância a pH entre 2 e 10 (Drobniewski, 1993). 

Este género produz enzimas hidrolíticas extracelulares que têm a capacidade de degradar a maioria dos substratos provenientes de plantas e animais, como celulose, amido, pectina, proteínas, agar e outros hidratos de carbono (Madigan e Martinko, 2006). 

Em algumas espécies é reconhecida a produção de antibióticos (Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus e Bacillus subtilis), a nitrificação e desnitrificação (Bacillus azotoformans, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis), a fixação de azoto e o parasitismo (Bacillus thuringiensis) (Schnepf et al., 1998; Souto et al., 2004).

Como os solos são variáveis em termos de nutrientes, disponibilidade de água e temperatura, a esporulação para as bactérias que aí se desenvolvem, torna-se um processo fundamental em termos de sobrevivência.

3. Processo de esporulação 

A formação de endósporos pode ser despoletada por condições nutricionais desfavoráveis como a falta de água ou fontes de carbono e/ou azoto. O processo de diferenciação dura cerca de 8 horas e inicia-se a partir da fase estacionária do crescimento bacteriano, distinguindo-se sete fases quanto ao desenvolvimento do endósporo (Figura 5). Durante o processo de esporulação ocorrem reações complexas em cascata (Dricks, 2004). 

Na fase I ocorre a duplicação do DNA na célula vegetativa e o alongamento do material nuclear formando um filamento axial.


A fase II caracteriza-se pela formação/invaginação da membrana citoplasmática com formação do septo assimétrico (que apresenta duas membranas) e a compartimentalização de uma das cópias do DNA e de uma pequena porção de citoplasma - o protoplasto. 

Na fase III, o protoplasto é envolvido pela membrana da célula-mãe e forma o pré-endósporo. 

Na fase IV, ocorre a formação do córtex entre as duas membranas. Também se forma uma parede celular germinativa que é uma camada espessa de peptidoglicano altamente ligada entre o córtex e o núcleo. 

Na fase V, ocorre a formação das membranas (interna e externa), da capa de natureza proteíca e do exospório. 

Na fase VI é concluída a síntese da capa e ocorre a perda de água no núcleo, tornando-o mais resistente ao calor e mais refráctil. Nesta fase, observa-se o endósporo 
maduro sendo difícil a penetração dos fixadores usados em microscopia eletrônica. 
Na fase VII, a quantidade de água diminui e dá-se a libertação do endósporo por autólise da célula vegetativa, com a ação de autolisinas (Madigan e Martinko, 2006).

A elevada resistência dos endósporos permite que persistam ao longo do tempo geológico e a sobrevivência dos endósporos no espaço extra-terrestre tem sido também amplamente estudada (Nicholson, 2002). 

Em 1995, foram isolados endósporos de B. sphaericus em amostras de âmbar com 25 a 40 milhões de anos (Cano e Borucki, 1995). No ano de 2000, foi isolado Virgibacillus sp. 2-9-3, uma bactéria halo-tolerante formadora de endósporos, em cristais de halite com 250 milhões de anos (Vreeland et al., 2000; Nicholson, 2002). 

Esta longevidade do endósporo pode relacionar-se com a protecção do material genético 
durante a fase de dormência e os mecanismos de reparação dos danos do DNA durante a 
germinação (Setlow, 1995; Nicholson et al., 2000). 

Uma vez que os endósporos conservam o material genético das células que os originaram, podem germinar, em condições adequadas, voltando a originar células vegetativas idênticas. 

O processo de germinação pode ser espontâneo, quando em condições favoráveis tais como a presença de nutrientes inorgânicos, aminoácidos e açúcares, ou ainda induzido por situações de stresse como o calor, a pressão hidrostática, o baixo pH, agentes químicos (mercaptoetanol, dodeciclamina, DPA-Ca2+) ou pelo armazenamento durante meses a 4ºC ou à temperatura ambiente (Gould, 2006). É um processo rápido e irreverssível que envolve a degradação do córtex e a excreção do dipicolinato de cálcio para o meio exterior por activação das autolisinas, ocorrendo também a degradação das SASP que permitem a libertação do DNA do endósporo (Paidhungat et al., 2001). A absorção de água e a síntese de DNA, RNA e proteínas também fazem parte do processo de germinação. A célula vegetativa é libertada por rebentamento das membranas e inicia-se o seu crescimento.


Resumindo ...  "Endósporo. (Grego- endon- interno + rad esporo) Forma de resistência e reprodução de organismos inferiores como bactérias, fungos, algas.Define-se como espessamento da membrana celular, formando uma forma rígida, que pode ser esférica ou alongado (esporo), no interior do qual a célula é capaz de resistir ao processo de perda de água (desidratação) e altas temperaturas ou a congelamentos, ficando no estado de dormência por tempo indeterminado. Durante o tempo de dormência esse organismo se divide uma ou mais vezes, quando o ambiente torna-se novamente favorável o esporo se rompe liberando novos indivíduos."

"O esporo ou endósporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e outros agentes químicos e físicos, sendo capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. O esporo é formado por vários envoltórios. O primeiro, mais externo, fino, formado por proteínas, é denominado exospório. Abaixo do exospório fica a capa do esporo, formada por várias camadas de proteínas ricas em ligações de dissulfetos, responsáveis pela resistência do esporo a agentes químicos e físicos. Mais internamente fica o córtex do esporo, formado por camadas de peptidioglicano. Abaixo do córtex localiza-se o protoplasto ou núcleo do esporo formado pela parede celular, citoplasma, material genético etc, provenientes da célula vegetativa. Os esporos são difíceis de serem corados pois os corantes geralmente não atravessam a parede do esporo a não ser que seja utilizado o calor, como na coloração de Schaeffer-Fulton."

  "A esporulação, processo pelo qual alguns gêneros de bactérias formam esporos, ocorre quando estas bactérias estão face a situações críticas para sua sobrevivência, ou seja, as condições ambientais são adversas para o crescimento bacteriano. De maneira geral, isto ocorre quando há falta de nutrientes, como carbono ou nitrogênio.
         Os esporos apresentam-se sob a forma de corpúsculos esféricos ou ovóides, livres ou no interior da bactéria. Formam-se pela invaginação de uma dupla camada de membrana celular, que se fecha para envolver um cromossoma e uma pequena quantidade de citoplasma, garantindo a sobrevivência da espécie. Esta camada é responsável pela resistência à coloração e ao ataque dos agentes físicos e químicos da esterilização e desinfecção. São características comuns aos esporos: decréscimo na quantidade total de água em comparação com o estado vegetativo, refratividade, alta resistência a condições ambientais adversas, habilidade de germinar e produzir células vegetativas após longos períodos de estocagem.
         Na fase esporulada, as bactérias não realizam atividade biossintética e reduzem sua atividade respiratória. Nesta fase também não ocorre a multiplicação e crescimento bacteriano. Esta incapacidade de reprodução pode ser devida a basicamente dois fatores: a) incapacidade de iniciar a germinação; b) incapacidade de duplicar macro moléculas críticas para seu metabolismo.
       As bactérias podem permanecer viáveis na forma de esporos durante anos, se mantidos a temperaturas usuais e em estado seco. Entretanto, assim que o ambiente se torna favorável, estes esporos podem voltar a se reproduzir e multiplicar"

"Os esporos são observados mais simplesmente na forma de corpúsculos intracelulares refrateis em suspensões de células não coradas ou como áreas incolores em células coradas por métodos convencionais. A parede do esporo é relativamente impermeável, porém os corantes podem atravessá-la mediante o aquecimento da preparação. A seguir, a mesma impermeabilidade serve para evitar a descoloração do esporo pelo tratamento com álcool, suficiente para descorar as células vegetativas, que podem ser finalmente contracoradas. Comumente, os esporos são corados com verde de malaquita ou carbolfucsina."

Colocando em prática - Executando a coloração


Há determinados géneros de bactérias (ex. Clostridium, Bacillus) que têm capacidade para existir como células vegetativas metabolicamente activas ou como células altamente resistentes, mas metabolicamente inactivas, chamadas esporos.
        Quando as condições ambientais se tornam desfavoráveis para a actividade das células vegetativas, estas células têm a possibilidade de sofrer esporogénese e formar uma nova estrutura intracelular - endósporo. Se as condições continuam adversas o endósporo é libertado da célula vegetativa degenerativa e torna-se uma célula independente - esporo. Quando as condições voltam a ser favoráveis o esporo livre pode-se reverter numa célula metabolicamente activa, mas menos resistente através da germinação. A esporogénese e a germinação não são meios de reprodução, mas apenas mecanismos que asseguram a sobrevivência das células em todas as condições ambientais.
            Os esporos devido à composição química das suas camadas impermeáveis (“spore coats”) são muito resistentes ao calor, ao congelamento, às radiações e aos agentes químicos, tal como aos corantes geralmente utilizados. Os esporos são difíceis de corar pelas técnicas de coloração usuais (simples e Gram), apresentando-se refringentes porque o corante não penetrou, enquanto o corpo bacteriano se apresenta corado.
            O tamanho, a forma e a localização dos endósporos variam com as espécies, o que os torna importantes na identificação das bactérias. Os endósporos podem apresentar-se com a forma esférica ou ovóide e com dimensões maiores ou menores que a célula que lhe deu origem. A posição do endósporo dentro da célula é característica, podendo ser central, subterminal ou terminal.

            A coloração de Conklin utiliza três reagentes diferentes:

1) corante primário: verde de malaquita
Ao contrário da maior parte das células vegetativas que coram pelos procedimentos comuns, os esporos, devido ao seu revestimento impermeável, não aceitam facilmente o corante primário. Após a colocação do primeiro corante é necessário aplicar calor para facilitar a coloração e assim vão aparecer os esporos e as células vegetativas coradas de verde.

2) lavagem com água
Uma vez que o esporo aceitou o verde de malaquita ele não é retirado pela água, a qual remove apenas o excesso de corante primário. Deste modo o esporo mantém-se verde e as células vegetativas ficam incolores porque o corante primário não tem uma grande afinidade pelos componentes destas células.

3) corante de contraste: safranina
É usado para corar as células vegetativas previamente descoradas, que vão absorver agora este corante e aparecer coradas de vermelho. Os esporos retêm a cor verde do corante primário. Esta técnica origina um endósporo verde dentro de uma célula avermelhada.


Execução prática:

·      Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação). Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

·      Cobrir o esfregaço com um bocado de papel de filtro do tamanho da lâmina.

·     Saturar o papel com verde de malaquita e colocar a preparação num local quente (sobre a chama) durante 2 a 3 minutos. Não deixar que o corante evapore nem que entre em fervura. (Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante verde de malaquita e manter a lâmina sobre a chama do bico de Bunsen até o corante emitir vapores. Deixar esfriar por cinco minutos. Enxaguar a lâmina com água.)

·      Deixar arrefecer a lâmina e lavá-la com água corrente.

·      Cobrir o esfregaço com safranina e deixar atuar durante 30 segundos. (Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante safranina ou fucsina; deixar em repouso por trinta segundos. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.) 

·      Lavar em água corrente sempre com a lâmina inclinada.

·      Secar em papel de filtro e observar ao MO em objectiva de imersão.


Resultados
Examinar a amostra ao microscópio óptico. As células vegetativas aparecem coradas em vermelho e os endósporos aparecem corados em verde.



Para quem quiser uma apostila para prática em laboratório, esta que achei na internet, contém uma pequena explicação de cada coloração e local para anotar os resultados. Lembrando que se deve entrar em um laboratório já conhecendo a técnica, pegando livros ou com um professor responsável, para um aprendizado correto e seguro! Baixe a apostila clicando aqui.


Referências Bibliográficas

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 40,41. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Associação Paulista de Estudos e Controle de Infecção Hospitalar (APECIH). Esterilização de Artigos em Unidades de Saúde. São Paulo, 1998.

STANIER, R.Y.; DOUDOROFF, M.; ADELBERG, E.A.  Mundo dos micróbios. São Paulo. Edgard Blücher Ltda, 1969.

Disponível em: http://ria.ua.pt/bitstream/10773/795/1/2009000537.pdf; acessado em 24/08/2013 às 11:02

Disponível em: http://www.cisoja.com.br/downloads/legislacao/anexo_IN_062_7.pdf; acessado em 24/08/2013 às 11:33





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